Bài 2: Nguyên Lí Tách Chiết DNA | Chuyên đề học tập Sinh học 12 | Chuyên Đề 1: Sinh Học Phân Tử - Lớp 12 - Kết Nối Tri Thức Với Cuộc Sống

Trang 13

YÊU CẦU CẦN ĐẠT

• Nêu được các nguyên lí của phương pháp tách chiết DNA từ tế bào.

• Nêu được một số phương pháp phân lập gene.

I. NGUYÊN LÍ

Để tách được DNA linh khiết từ tế bào, về nguyên lí, cần phải phá vỡ tế bào và tách DNA khỏi các loại protein, RNA và các chất khác liên kết với DNA. Tách chiết DNA là quy trình kết hợp nhiều kĩ thuật sinh học phân tử phức tạp nhưng có thể tóm tắt bằng quy trình bốn bước ở Hình 2.1.

Hình 2.1. Các bước trong quy trình tách chiết DNA điển hình

Mẫu sinh phẩm (tế bào/mô mang gene đích)

Phá vỡ tế bào bằng phương pháp lí - hóa (sử dụng chất tẩy rửa loại bỏ màng lipid)

Biến tính và loại bỏ protein (bằng phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ và enzyme protease)

Biến tính và loại bỏ RNA (bằng phương pháp sử dụng enzyme RNase}

Kết tủa và tinh sạch DNA (bằng phương pháp sử dụng ethanol lạnh kết hợp li tâm)

Bước 1: Phá vỡ tế bào

Trước tiên, cần phá vỡ màng tế bào để giải phóng các thành phần của tế bào (trong đó có DNA, RNA và protein) vào dung dịch tách chiết. Các tế bào động, thực vật nuôi cấy hay
vi khuẩn thuờng tổn hại ở dạng các tế bào riêng rẽ nên việc phá vỡ tế bào thường tương đối đơn giản. Ngược lạ, các mô thực vật và động vật thường cần phải được nghiền nhỏ trong nitrogen

Trang 14

lỏng để phá vỡ cấu trúc mô trước khi phá vỡ các tế bào. Đối với các tế bào có thành tế bào, trước khi phá huỷ màng tế bào cần sử dụng enzyme phân giải thành tế bào, chẳng hạn như cellulase dùng cho tế bào thực vật, chitinase cho tế bào năm và lysozyme dùng cho tế bào vi khuẩn, sử dụng các chất tẩy rửa như cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) có thể phân giải lớp màng tế bào và giải phóng các thành phần tế bào vào dung dịch chiết xuất.

Bước 2: Loại bỏ protein

Phân tử DNA trong tế bào thường liên kết với nhiều protein (như histone, các protein điều hoà và phiên mã) nên muốn thu được DNA tinh khiết cần loại bỏ các protein. Phần lớn protein được loại bỏ bằng hỗn hợp dung môi hữu cơ gồm phenol và chloroform (tỉ lệ thể tích 1:1), Dung môi này gây kết tủa protein mà không kết tủa các nucleic acid (DNA và RNA). Phần dịch giàu DNA và RNA được hút ra bằng pipette. Các protein còn sót lại (do phương pháp dung môi không loại hết) được phân giải bằng enzyme protease (như proteinase K) thành các amino acid hoặc đoạn peptide nhỏ.

Bước 3: Loại bỏ RNA

RNA được loại bỏ bằng cách cho enzyme ribonuclease (như RNase A) vào dịch chiết tế bào chứa hỗn hợp DNA và RNA. Ribonuclease sẽ phân cắt các chuỗi RNA thành các ribonucleotide mà không phân giải DNA. Lúc này, dịch chiết tế bào chỉ còn toàn DNA.

Bước 4: Kết tủa và tinh sạch DNA

DNA trong dịch chiết được xử lí với ethanol lạnh để kết tủa, DNA kết tủa thường ở dạng sợi và có thể tách ra khỏi dịch chiết bằng đũa hoặc thừa (H 2.2). Đôi khi, kĩ thuật li tâm có thể được sử dụng để thu DNA kết tủa ở dạng cặn lắng sau li tâm và rửa lại vài lần bằng ethanol lạnh. Cặn DNA đã tính sạch sau đó được hoà tan và lưu giữ trong dung dịch nước có độ pH ổn định (dung dịch đệm) để phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo.

Hỗn hợp DNA thu được sau tách chiết là toàn bộ DNA của tế bào còn được gọi là DNA hệ gene hay DNA tổng số.

Hình 2.2. Khi dịch chiết được xử lí ethanol lạnh, DNA bị kết tủa (có thể được lấy ra bằng đũa thí nghiệm)

Trang 15

II. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP GENE

Để phân lập từng qene riêng rẻ rA khỏi hệ gene, các nhà khoa học có thể sử dụng các phương pháp khác nhau. Gene có thể được tách trực tiếp khỏi bộ gen hoặc tách chiết một cách gián tiếp thông qua mRNA của gene.

1. Tách chiết gen trục tiếp từ hệ gene

Khi gene quan tâm (gene chuyển) có chứa trình tự nhận biết của một loại enzyme cắt giới hạn nằm ở hai đầu của gene thì có thể tách được gene ra khởi hệ gene theo phương pháp sử dụng enzyme cắt giới hạn. Mỗi loại enzyme chỉ cắt DNA ở một trình tự nucleotide nhất định. Enzyme cắt giới hạn đầu tiên được phân lập có tên là Hindll và cách thức hoạt động của nó đã được làm rõ vào năm 1968. Các nhà khoa học phát hiện ra rằng, Hindll luôn cắt phân tử DNA tại một vị trí nhất định có trình tự gồm 6 nucleotide. Các enzyme cắt giới hạn khác nhau nhận biết và cắt tại các trình tự nucleotide khác nhau được gọi là trình tự giới hạn (thường là chuỗi gồm từ 4 đến 8 nucleotide trên DNA. Ngoài Hindll và Hindlll, đến nay các nhà khoa học đã phát hiện ra hơn 900 enzyme cắt giới hạn (được phân lập từ khoảng 230 chủng vi khuẩn) có trình tự giới hạn khác nhau. Điều thú vị là các trình tự giới hạn có đặc điểm "bắt đôi bổ sung đối xứng ngược chiều" trên hai mạch, chẳng hạn trình tự giới hạn của Hindll ở mạch 5' - 3' là 5' - GTTAAC - 3' thì mạch bổ sung sẽ là 3' - CAATTG - 5', tuy nhiên, mạch bổ sung khi được đọc theo chiỀu 5' - 3' sẽ giống hệt mạch kia. Enzyme cắt giới hạn thường cắt DNA thành các đoạn có đầu với hai mạch dài, ngắn khác nhau được gọi là “đầu dính" (H2.3). Nhờ vậy các đoạn DNA từ các nguồn khác nhau được cắt bởi cùng một loại enzyme cắt giới hạn có thể liên kết bổ sung với nhau tạo ra được DNA tái tổ hợp.

Hình 2.3. Trình tự giới hạn của Hindll

1. Một số enzyme cắt giới hạn như Hindlll, tạo ra các vết cắt so le trong DNA

2. ... tạo ra các đầu dính so le

Nhờ đặc điểm của các enzyme cắt giới hạn là luôn cắt phân tử DNA tại chuỗi trình tự đặc hiệu nên người ta có thể phân lập gene khi biết trình tự vùng biên ở hai đầu 5' và 3' của gene đó có trình tự giới hạn của một loại enzyme cắt giới hạn. Phương pháp này có thể sử dụng một hoặc kết hợp nhiều enzyme giới hạn khác nhau (khi trình tự giới hạn ở hai đầu gene không giống nhau) hoặc kết hợp với DNA methylase (để bảo vệ các chuỗi nucleotide trong gene tránh bị tác động bởi enzyme giới hạn).

Hình 2.4 cho thấy gene sau khi được cắt khỏi hệ gene có thể được nhân bản tạo ra nhiều bản sao trong tế bào vi khuẩn (nhân dòng gene) hoặc nhân bản trong ống nghiệm bằng PCR.

Hình 2.4. Nhân bản gene trong tế bào (a) và ống nghiệm (b)

Gene chuyển

Vector

Ligase

Hệ gene của vi khuẩn

a) Tế bào vi khuẩn phân chia thành công

a) Nhân bản gene trong ống nghiệm (PCR)

Trang 16

Khi ở hai đầu của một gene không có trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn thì dù không thể tách tự tiếp gene ra khỏi hệ gene, các nhà khoa học vẫn có thể tổng hợp được gene đó nhờ kĩ thuật tạo ra nhiều bản sao của gene trong ống nghiệm được gọi là phương pháp PCR. Phương pháp này có thể nhân bản một đoạn trình tự DNA đích trong ống nghiệm (in vitro) bằng cách sử dụng cặp mồi đặc hiệu tương ứng với đầu 5' (mồi xuôi và 3' (mồi ngược) của đoạn DNA đích nhờ enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (Taq DNA polymerase, được phân lập từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus). Các mồi PCR có thể được chế tạo gồm chuỗi nucleotide bất kì (không bị hạn chế như các trình tự giới hạn).

Do đó, khi đã biết chuỗi trình tự ở hai đầu của một gene (thường có tính đặc thù ở mỗi gene) thì có thể chế tạo cặp mồi PCR có trình tự bổ sung tương ứng (dài khoảng 20 - 25 nucleotide) và phân lập qua nhân bản được gene đích tử các phân tử DNA vốn rất dài của hệ gene. Hình 2.5 minh hoạ nguyên phân lập gene (đoạn DNA) đích bằng PCR.

Hình 2.5. Phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase(PCR). Mỗi chu kì gầm 3 bước (1) Biến tính, (2) Gắn mồi, (3) Kéo dài chuỗi từ mồi

Đoạn DNA đích (cần nhân bản)

1. Biến tính: Tăng nhiệt độ gây biến tính

2. Gắn mồi: Giảm nhiệt độ để gắn mồi RNA

3. Kéo dài chuỗi: Cung cấp DNA polymerase (Taq polymerase) và các dNPT (dATP, dTTP, dGTP, dCTP)

Thực hiện khoảng 30 chu kì

Đoạn DNA đích được nhân bản (khoảng 1 tỷ bản sao)

2. Tách chiết gene qua mRNA

Các gene của sinh vật nhân thực thường là gene phân mảnh vì trong vùng mã hoá chứa các intron. Nếu muốn chuyển gene của sinh vật nhân thực vào tế bào nhân sơ để nó có thể phiên mã, gene của tế bào nhân thực cần phải được loại bỏ các intron và ghép các exon lại với nhau thành một exon duy nhất. Vùng mã hoá chỉ gồm có exon của sinh vật nhân thực, được gắn vào vector có các trình tự điều hoà hoạt động gene của sinh vật nhân sơ rồi đưa vào tế bào

Trang 17

vi khuẩn thì gene của tế bào nhân thực mới có thể dược phiên mã và dịch mô. Để tạo ra được gene của tế bào nhân thực chỉ chứa toàn exon, các nhà khoa học thường tách mRNA trưởng thành (không còn intron ra khỏi tế bào nhân thực sau đó dùng enzyme phiên mã ngược tổng hợp nên mạch DNA bổ sung với RNA. DNA được tổng hợp từ mRNA như vậy được gọi là cDNA. Kĩ thuật tổng hợp cDNA và tạo ra nhiều bản sao dựa trên kĩ thuật PCR được gọi là RT-PCR. Hình 2.6 minh họa các bước của quy trình RT-PCR được dùng để phân lặp gene (ở dạng cDNA) từ hỗn hợp mRNA chiết xuất từ tế bào.

Trước tiên, mRNA được tách chiết và tinh sạch theo các bước tương tự như trong quy trình tách chiết DNA được trình bày ở mục I. Tuy nhirrn, hỗn hợp mRNA thu được thường đồng thời chứa hàng nghìn lọai mRNA khác nhau (mỗi loại mRNA tương ứng với một gene mã hoá protein. Các mRNA này đều giống nhau khi có đuôi PolyA ở đầu 3' (được tế bào gắn vào trong quá tình phiên mã) nên phản ứng RT-PCR dùng mồi PolyT để nhân mạch cDNA thứ nhất liên kết bổ sung với các mạch khuôn mRNA. Mỗi gene thường có các chuỗi trình tự đầu 5' và 3' đặc trưng nên những trình tự này được dùng để thiết kế cặp mồi cho phản ứng PCR trong bước tiếp theo giúp nhân bản chọn lọc gene đích đặc hiệu.

Hình 2.6. Phản ứng RT-PCR sử dụng enzyme phiên nmã ngược để phân lập cDNA từ hỗn hợp mRNA

Mạch mRNA khuôn

1. Gắn mồi PolyT

Đoạn mồi PolyT

2. RT tổng hợp mạch DNA thứ nhất

Reserve transcriptase (RT)

cDNA (mạch thứ nhất)

3. Phản ứng PCR

Taq polymerase

Đoạn mồi đặc trưng

Mạch thứ hai được tổng hợp từ mạch cDNA thứ nhất

Khoảng 30 chu kì

Đoạn cDNA đích (không mang intron) của gene được nhân bản

Trang 18

Như vậy, cDNA chính là đoạn DNA chứa chuỗi nucleotide của gene mã hoá chuỗi amino acid trên phân tử protein được tế bào dịch mã. Tập hợp các cDNA (tương ứng với các gene khác nhau của một mô hoặc một sinh vật) được gọi là thư viện cDNA, phản ánh tập hợp tất cả các gene được biểu biện ở mô (loại tế bào) hoặc sinh vật dó.

LUYỆN TẬP VÀ VẬN DỤNG

1. Việc sử dụng các enzyme trong các quy trình tách chiết DNA cho thấy enzyme có kích thước lớn hơn hay nhỏ hơn so với phân tử DNA? Bằng cách nào em biết được điều đó?

2. Tại sao DNA của vi khuẩn không bị cắt bởi các enzyme giới hạn sẵn có trong tế bào của chúng? (Gợi ý: Chỉ dùng enzyme cắt giới hạn để cắt DNA khi không còn protein nào liên kết với DNA)

3. Em hãy đề xuất một quy trình tách chiết RNA, biết rằng trong khi enzyme ribonuclease (như Rnase A) phân huỷ đặc hiệu RNA thì enzyme deoxyribonuclease (như DNase) phân huỷ độc hiệu DNA. Kiểm chứng giả thuyết bằng cách tìm kiếm "Quy trình tách chiết RNA" trên mạng internet.

Em có biết?

Công nghệ giải trình tự DNA được quan tâm nghiên cứu và phát triển nhanh chóng trong 50 năm qua, nhờ vậy tốc độ giải trình tự các hệ gene sinh vật ngày càng nhanh và giá thành ngày càng giảm. Sau khi Frederik Sanger sáng chế ra phương pháp giải trình tự DNA sử dụng ddNTPs vào năm 1975, công nghệ giải trình tự DNA tự động (thế hệ thứ hai, viết tắt là NGS) ra đời vào những năm 1990 nhờ kết hợp với công nghệ tin sinh học. Công nghệ NGS đã giúp rút ngắn thời gian giải trình tự toàn bộ hệ gene người đầu tiên, gồm 3 tỉ cặp nucleotide, từ 20 năm (dự kiến năm 1990 đến năm 2010) xuống còn 14 năm (hoàn thành năm 2004). Ngày nay công nghệ giải ttình tự thế hệ thứ ba áp dụng vật liệu nano còn cho tốc độ và độ chính xác cao một cách đáng kinh ngạc Thời gian cần để giải trình tự DNA của toàn bộ hệ gene người chỉ trong vòng 1 giờ.