Bài 6: Thực hành: Tách chiết DNA | Sinh Học 12 | Phần bốn. Di truyền học - Chương I. Di truyền phân tử - Lớp 12 - Kết Nối Tri Thức Với Cuộc Sống

(Trang 31)

I. YÊU CẦU CẦN ĐẠT

Thực hành tách chiết được DNA từ các mẫu vật sống.

II. CHUẨN BỊ

1. Dụng cụ, thiết bị

- Chày, cối sứ hoặc máy xay thịt, máy nghiền mẫu vật sống.

- Ống nghiệm thuỷ tinh, giá đỡ ống nghiệm, giấy lọc và phễu lọc.

- Tăm tre dài hoặc que tre tròn hay que thuỷ tinh.

2. Nguyên liệu, hoá chất, mẫu vật

- Gan gà hoặc mô động vật, thực vật tươi sống bất kì. Tùy điều kiện thực tế để lựa chọn mẫu vật cho phù hợp.

- Dứa tươi: 1/4 quả.

- Cồn ethanol lạnh (70 – 95%): 500mL.

Lưu ý:

- Mô thực vật thường chứa nhiều nước, ít DNA hơn so với mô động vật, đồng thời có chứa diệp lục hoặc các sắc tố nên cần phải loại bỏ sắc tố trước khi tách chiết thì mới quan sát được kết tủa DNA. Nếu có điều kiện, nên sử dụng mẫu vật là gan gà hoặc gan lợn (như trình bày trong thực hành) vừa dễ nghiền, vừa giàu DNA.

- Khối lượng mẫu vật sống được sử dụng có thể thay đổi tùy theo đối tượng sử dụng (đối với mẫu vật là gan, thịt động vật, thường sử dụng khoảng 5 g; đối với mẫu thực vật, thường sử dụng 50 g).

- Trong cùng một lớp, mỗi nhóm học sinh có thể làm với một loại mẫu vật để xem loại mô nào cho nhiều DNA hơn.

III. NGUYÊN LÍ VÀ CÁCH TIẾN HÀNH

1. Nguyên lí

- Do DNA tồn tại trong nhân tế bào nên để tách chiết được DNA ra khỏi tế bào, cần phá vỡ mô để tách rời các tế bào và phá huỷ thành tế bào bằng việc nghiền mẫu vật trong cối hoặc trong máy xay; phá huỷ màng tế bào, màng nhân bằng các dung dịch tẩy rửa hoà tan lipid nhằm giải phóng dịch nhân tế bào vào dung dịch chiết xuất.

- Trong tế bào, DNA liên kết với nhiều protein (như histone, các protein điều hòa và phiên mã), nên cần loại bỏ các protein bằng enzyme phân giải protein là protease (có trong nước ép dứa tươi) để phân cắt chuỗi polypeptide thành các amino acid đơn phân hoặc đoạn peptide nhỏ, dung dịch lúc này chỉ còn các đại phân tử DNA và RNA.

(Trang 32)

- Để tách DNA ra khỏi dung dịch chiết xuất, cần kết tủa DNA bằng ethanol. Do ethanol có ái lực với nước mạnh hơn với DNA nên khi cho cồn ethenol vào dịch chiết chứa DNA thì các phân tử DNA có xu hướng bị đẩy sát lại gần nhau và kết tụ lại với nhau dưới dạng vật chất có màu trắng đục.

- Vì ethanol nhẹ hơn nước nên khi cho ethanol vào phía trên dịch chiết tế bào sẽ tách thành lớp trong suốt trong ống nghiệm phía bên trên, lúc này DNA sẽ đi từ dịch chiết tế bào lên và bị kết tủa dưới dạng vật chất có màu trắng đục. Do bị kết tủa, DNA trở nên dễ gãy nên cần nhẹ tay khi thao tác vớt DNA ra khỏi ống nghiệm.

Lưu ý:

Chất kết tủa màu trắng thu được theo quy trình thí nghiệm này chủ yếu là DNA và có thể nhận biết bằng dung dịch diphenylamine ở nhiệt độ cao tạo phức màu xanh lam. Tuy nhiên, trong khuôn khổ bài thực hành này, chúng ta không đủ thời gian và điều kiện để làm thí nghiệm đó.

2. Cách tiến hành

Quy trình dưới đây mô tả các bước tách chiết DNA với mẫu vật là gan gà.

- Bước 1: Nghiền khoảng 5g gan gà trong cối sứ hoặc xay trong cối xay thịt thật kĩ sao cho gan được xay nhỏ nhất (nêu dùng máy xay thì khoảng 30 - 60 giây). Sau đó cho thêm khoảng 150mL nước lạnh vào, khuấy đều. Lấy 1/4 quả dứa đã gọt vỏ, đem nghiền, ép lấy nước dứa và đổ vào một ống nghiệm.

- Bước 2: Dung dịch chứa các tế bào gan xay được lọc qua phễu lọc để loại bỏ phần cặn, chỉ lấy dịch nước trong.

- Bước 3: Chọ dịch lọc vào trong một ống nghiệm khác cùng với 30mL dung dịch nước rửa bát pha loãng, khuấy đều sau đó để yên trên giá ống nghiệm khoảng 5 - 10 phút.

- Bước 4: Rót hỗn hợp dịch gan gà cùng nước rửa bát lấy từ bước 3 sang ống nghiệm mới với thể tích dịch khoảng 1/3 đến 1/2 ống nghiệm; bổ sung 5 mL nước dứa tươi vào ống nghiệm và khuấy nhẹ rồi để yên trong khoảng 10 phút.

- Bước 5: Ống nghiệm lấy từ bước 4 được đổ thêm cồn ethanol theo cách rót cồn chảy từ từ theo thành ống nghiệm cho đến khi gần đầy ống nghiệm. Sau ít phút, chất màu trắng kết tủa sẽ nổi lên ở lớp cồn phía trên ống nghiệm đây chính là các sợi DNA được kết tủa. Dùng tăm tre hoặc đũa thuỷ tinh quấn lấy DNA và đưa ra khỏi ống nghiệm. Lưu ý: xoay nhẹ tăm tre hoặc đũa thuỷ tinh để DNA bám vào, tránh làm mạnh tay sẽ khiến DNA bị gãy vụn, không lấy ra được.

Toàn bộ quy trình tách chiết DNA được khái quát trong Hình 6.1.

(Trang 33)

Máy xay; Cối sứ; Giấy lọc lót phễu → Dịch lọc bỏ cặn → Đũa thủy tinh; Nước rửa bát → Dịch lọc bỏ cặn cho vào ống nghiệm → Nước cốt dứa → Hỗn hợp dịch lọc bỏ cặn và nước rửa bát → Cồn etanol → DNA kết tủa → Ảnh chụp ống nghiệm chứa DNA kết tủa

Hình 6.1. Quy trình tách chiết DNA từ các tế bào gan gà

IV. THU HOẠCH

Học sinh viết báo cáo thực hành theo các nội dung sau:

(Trang 34)

SƠ ĐỒ TÓM TẮT KIẾN THỨC CHƯƠNG 1

DNA - cấu tạo → Đa phân; Nguyên tắc bổ sung - chức năng → Bảo quản thông tin; Mang thông tin; Truyền đạt thông tin

DNA - tập hợp các phân tử DNA trong tế bào → Hệ gene

DNA → Tái bản - Bán bảo toàn; Nguyên tắc bổ sung - đảm bảo → Thông tin di truyền được truyền đạt nguyên vẹn qua các thế hệ tế bào và cơ thể

DNA - ghép nối DNA khác loại → DNA tái tổ hợp → Nhân dòng gene; Tạo sinh vật biến đổi gene

DNA - một đoạn DNA → Gene - phiên mã → RNA - dịch mã → Protein - biểu hiện → Tính trạng

Gene - cấu trúc → Vùng điều hòa; Vùng mã hóa; Vùng kết thúc

Gene → Điều hòa hoạt động gene - theo → Operon → Các gene mã hóa; Vùng điều hòa

Gene - thay đổi số lượng, trình tự nucleotide → Đột biến gene - phân loại (Thêm/ mất cặp nucleotide; Thay thế cặp nucleotide); ý nghĩa (Nguyên liệu cho tiến hóa và chọn giống; Nghiên cứu di truyền học; Tạo giống)